本書內(nèi)容主要基于作者團(tuán)隊(duì)建立的多種用于抗真菌藥物篩選和活性評(píng)價(jià)的醫(yī)學(xué)真菌生物實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作方法，旨在為真菌藥物研發(fā)提供參考依據(jù)。主要內(nèi)容分為四篇：第1篇，體外抗真菌活性篩選常用方法；第2篇，抗真菌作用機(jī)制研究常用方法；第3篇，真菌感染動(dòng)物模型建立及體內(nèi)抗真菌活性評(píng)價(jià)；第4篇，常用的真菌分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)及應(yīng)用舉例。
本書可為真菌相關(guān)研究的科研工作者提供標(biāo)準(zhǔn)和參考。

劉娜，海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系副教授、碩士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榭拐婢幬镅芯浚饕劢褂诳拐婢掳悬c(diǎn)、新機(jī)制和新分子骨架發(fā)現(xiàn)。作為項(xiàng)目負(fù)責(zé)人主持國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2項(xiàng)）、青年基金、軍隊(duì)生物安全研究專項(xiàng)等6項(xiàng)研究課題；作為項(xiàng)目骨干參與國家杰出青年科學(xué)基金、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、上海市教委科技創(chuàng)新重大項(xiàng)目、上海市優(yōu)秀學(xué)術(shù)帶頭人等項(xiàng)目。發(fā)表SCI論文27篇，獲授權(quán)發(fā)明專利17項(xiàng)，參編中英文專著6部。作為主要完成人獲得上海市科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)，入選海軍軍醫(yī)大學(xué)遠(yuǎn)航人才計(jì)劃和A級(jí)優(yōu)秀教員，擔(dān)任《中南藥學(xué)》雜志編委。

真菌感染是臨床上一類常見病、多發(fā)病，分為深部真菌感染和淺部真菌感染。近年來，隨著免疫受損人群的增加，深部真菌感染的發(fā)病率和致死率大幅上升。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年約有數(shù)十億人會(huì)受到真菌感染，其中數(shù)百萬人所受感染是危及生命的。目前用于深部真菌感染臨床治療的抗真菌藥物數(shù)量十分有限，且普遍存在毒副作用大、耐藥性嚴(yán)重等問題，現(xiàn)有的抗真菌藥物遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床的需要。因此，開發(fā)新型的抗真菌藥物十分必要。國內(nèi)抗真菌藥物研發(fā)水平相對(duì)薄弱，抗真菌活性化合物發(fā)現(xiàn)和生物活性評(píng)價(jià)相對(duì)脫節(jié)，致使一些具有較好抗真菌活性的分子沒有得以深入的研究和評(píng)價(jià)。海軍軍醫(yī)大學(xué)盛春泉、劉娜團(tuán)隊(duì)多年來致力于抗真菌藥物研究工作，建立了多種用于抗真菌藥物篩選和活性評(píng)價(jià)的醫(yī)學(xué)真菌生物實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作方法，其中包括體外抗真菌活性測(cè)試方法、系統(tǒng)性真菌感染動(dòng)物模型的構(gòu)建、體內(nèi)抗真菌活性評(píng)價(jià)方法，以及與真菌相關(guān)的細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，并以此為基礎(chǔ)開展了大量的抗真菌新藥發(fā)現(xiàn)和作用機(jī)制研究，以及抗真菌新靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證工作。本書是這些方法的歸納總結(jié)，對(duì)從事真菌藥物研發(fā)有重要的參考價(jià)值。

真菌感染是臨床上一類常見病、多發(fā)病，分為深部真菌感染和淺部真菌感染。近年來，隨著免疫受損人群的增加，深部真菌感染的發(fā)病率和致死率大幅上升。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年有數(shù)十億人會(huì)受到真菌感染，其中數(shù)百萬人所受感染是危及生命的。目前用于深部真菌感染臨床治療的抗真菌藥物數(shù)量十分有限，且普遍存在毒副作用大、耐藥性嚴(yán)重等問題，現(xiàn)有的抗真菌藥物遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床的需要。因此，開發(fā)新型的抗真菌藥物十分必要。
藥物研發(fā)的基本流程：首先，針對(duì)疾病或靶標(biāo)建立生物活性評(píng)價(jià)方法；其次，篩選或者設(shè)計(jì)先導(dǎo)化合物；進(jìn)而，對(duì)先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化的同時(shí)進(jìn)行逐級(jí)評(píng)價(jià)，通常先體外評(píng)價(jià)生物活性和選擇性，再通過動(dòng)物模型測(cè)試體內(nèi)生物活性。目前，國內(nèi)抗真菌藥物研發(fā)水平相對(duì)薄弱，抗真菌活性化合物發(fā)現(xiàn)和生物活性評(píng)價(jià)相對(duì)脫節(jié)，致使一些具有較好抗真菌活性的分子沒有得以深入的研究和評(píng)價(jià)，而如何提高國內(nèi)抗真菌藥物研究的整體水平是業(yè)內(nèi)同行共同關(guān)注的問題。
作者研究團(tuán)隊(duì)多年來致力于抗真菌藥物研究工作，在參考大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合實(shí)際經(jīng)驗(yàn)，建立了多種用于抗真菌藥物篩選和活性評(píng)價(jià)的醫(yī)學(xué)真菌生物實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作方法，其中包括體外抗真菌活性測(cè)試方法、系統(tǒng)性真菌感染動(dòng)物模型的構(gòu)建、體內(nèi)抗真菌活性評(píng)價(jià)方法，以及與真菌相關(guān)的細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，并以此為基礎(chǔ)開展了大量的抗真菌新藥發(fā)現(xiàn)和作用機(jī)制研究，以及抗真菌新靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證工作。本書將上述真菌生物實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行梳理、總結(jié)，形成了四部分內(nèi)容：第1篇，體外抗真菌活性篩選常用方法；第2篇，抗真菌作用機(jī)制研究常用方法；第3篇，真菌感染動(dòng)物模型建立及體內(nèi)抗真菌活性評(píng)價(jià)；第4篇，常用的真菌分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)及應(yīng)用舉例。此外，附錄中羅列了常見病原真菌活化、凍存方法以及常用培養(yǎng)基的配制方案，旨在為同行提供參考的依據(jù)，助力抗真菌藥物的研究。
本書的編寫是在多位老師和研究生的共同努力下完成的，書中的實(shí)驗(yàn)方法在國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（No. 82330109）、國家杰出青年科學(xué)基金（No. 81725020）、國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（No. 82373734，No. 81973175）等多項(xiàng)基金的資助下建立，本書的編寫也得到多位同行的支持和幫助，在此一并表示感謝。
因?qū)W識(shí)和能力有限，書中難免存在不足之處，敬請(qǐng)讀者批評(píng)指正。

編者
2024年6月

第1篇 體外抗真菌活性篩選常用方法  001
1 體外抗真菌活性測(cè)試  002
2 體外協(xié)同抗真菌活性測(cè)試  006
3 馬拉色菌的體外抗真菌活性測(cè)試  010

第2篇 抗真菌作用機(jī)制研究常用方法  013
4 真菌與腫瘤細(xì)胞互作實(shí)驗(yàn)  014
5 平皿/紙片擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)  017
6 時(shí)間-生長曲線測(cè)試  020
7 時(shí)間-殺菌曲線測(cè)試  023
8 生物被膜形成抑制實(shí)驗(yàn)  026
9 成熟生物被膜清除實(shí)驗(yàn)  029
10 菌絲生長抑制實(shí)驗(yàn)  033
11 尿素酶生成抑制實(shí)驗(yàn)  036
12 黑素抑制實(shí)驗(yàn)  039
13 莢膜生長抑制實(shí)驗(yàn)  042
14 莢膜多糖含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)  045
15 真菌細(xì)胞表面疏水性測(cè)試  048
16 透射電子顯微鏡實(shí)驗(yàn)  051
17 真菌細(xì)胞共定位成像  054
18 真菌活細(xì)胞激光共聚焦實(shí)時(shí)成像  057
19 甾醇含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)  060
20 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)  063
21 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)  066

第3篇 真菌感染動(dòng)物模型建立及體內(nèi)抗真菌活性評(píng)價(jià)  069
22 小鼠系統(tǒng)性念珠菌感染模型  070
23 小鼠隱球菌性腦膜炎模型  073
24 小鼠皮膚感染模型  077
25 小鼠陰道炎感染模型  080
26 大蠟螟幼蟲模型  084
27 線蟲實(shí)驗(yàn)  087
28 血腦屏障透過實(shí)驗(yàn)  090

第4篇 常用的真菌分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)及應(yīng)用舉例  093
29 基因敲除技術(shù)  094
30 實(shí)時(shí)RT-PCR 實(shí)驗(yàn)  100
31 Western blot 實(shí)驗(yàn)  103
32 Hsp90 抑酶活性測(cè)試  106
33 HDAC 抑酶活性測(cè)試  110
34 組蛋白去甲基化酶抑酶活性測(cè)試  113

附錄  121
附錄1 常見病原真菌及其活化、凍存方法  122
附錄2 常用培養(yǎng)基及緩沖溶液的配制方法  127
附錄3 實(shí)驗(yàn)相關(guān)儀器  131
附錄4 縮略語表  132

參考文獻(xiàn)  134